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在蛋白质组的研究中 ,蛋白质和多肽的序列分析已不局限于阐明蛋白质的一级结构 ,对翻译后的修饰的进一步分析也是蛋白质化学的一项重要任务 。这种修饰对于蛋白质的功能非常重要 ,如:细胞识别中的蛋白质相互作用 ,信号传导和蛋白质定位 。
一 , 蛋白质的糖基化
从1D或2D凝胶得到的糖基化蛋白的识别 ,一般是进行MALDI-MS指纹分析 ,或是对MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片谱进行分析 。对完整的糖蛋白的研究是非常困难的 ,所有已知的离子化技术都有其局限性 。目前 ,人们主要研究糖肽 ,其好处之一就是质量减小了 ,这就会得到更好的分辨率 ,而且糖肽仍保留了糖基化位点 。将分离的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可进行糖肽的研究 。一旦糖肽被识别出 ,就可以用串连质谱(ESI-MS/MS)来阐明肽序列 。当蛋白的序列已知时 ,计算质量差就可推出其上附着的寡糖的质量 。
要将糖一部分从糖血清中施拉到 ,可检查是否上激光切或酶激光切 。现在 ,连有格局缜密性糖苷酶的质谱在增进字段 ,旁支和链接转换数剧角度是最扎实的技术性 。来说N糖基化常见的糖苷内切酶有PNGase-F,PNGase-A,EndoF和EndoH 。检查是否上激光切也都能否能够满足施放O-对接和N-对接的多糖 ,但往往出来的毛病是他会仍然破碎全部的的肽键 ,而使不见了对于糖悬挑脚手架位点的图片信息查询 。有时这么多激光切不能够从糖肽中多次施放单糖 。用肼的检查是否上激光切都能否弄掉三种内型的糖基化 。在60℃可缜密性的施放O-对接的糖 ,而在95℃能施放N-对接的糖 。施放O-原子团更常见的的方式是用碱实行β避免 。通常情况下 ,糖基内加入金屬阳铝离子在MALDI和ESI中阳铝离子化 。用MALDI-MS研究分析单糖的一款 好的抉择是将之与别一定类化合物混和 ,如此都能否逐渐骤增进流畅度和粪便率 。不同的的质谱的方式都能否带来多糖的源后裂解(PSD)和正碰引诱解离(CID)谱 ,这都能否根据有关于糖的字段 ,旁支及糖间的对接等图片信息查询 。
二 , 蛋白质的磷酸化
蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起重要的作用 。磷酸化经常作为分子开关控制不同过程蛋白质的活性 ,如新陈代谢 ,信号传导 ,细胞分裂等过程 。因此 ,蛋白质中磷酰氨基酸的识别在蛋白质分析中是一项重要的工作 。
已知的磷酰氨基酸的类型有四种:
(1)O-磷酸盐 ,通过羟氨酸的磷酸化形成的 ,如丝氨酸 ,苏氨酸 ,酪氨酸 。
(2)N-磷酸盐 ,通过精氨酸 ,赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的 。
(3)乙酰磷酸盐 ,通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的 。
(4)S-磷酸酯 ,通过半胱氨酸的磷酸化形成的 。
用质谱分析磷酸化时主要存在的问题是 ,混合物中磷酸化肽的信号被抑制 。因此只有当一些非磷酸化肽的含量降低(或磷酸化的肽被富集)后,分析磷酸化的肽才会变得容易些 。一些相应的用于质谱分析的前磷酸化肽或磷酸化蛋白质的分离和富集方法和技术已有所发展 ,现已建立的分离技术有:双向磷酸多肽谱图(2D-PP) ,高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC) 。对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测 ,提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析;如果32P标记不可行 ,就要用二手LC-MS/MS分析 ,常用HPLC与质谱联用 。
常见的生物丰度的策略有:固定好废金属材质亲和色谱(IMAC) ,IMAC是取舍性转移和生物丰度磷硝化作用肽比较多泛的的策略 。此的策略中,键合在螯合底物上的废金属材质铁离子(一般是Fe3+或Ga3+)取舍性地与磷硝化作用肽中的磷酸地方相根据, 还在高pH或磷酸缓解液中磷硝化作用肽就也是可以缓解压力得出来 。抵抗能力抗体力力检测凝固 ,高亲和性抵抗能力就也是可以从缜密混合式型物中抗体力力检测凝固某一的球蛋清 。近年来充分利用抵抗能力生物丰度球蛋清/肽仅限制于分享磷硝化作用酪氨酸,接下来用MALDI-TOF MS分享与抵抗能力相联结的磷硝化作用肽 。虽说使用在抗体力力检测凝固的抵抗能力对其底物应该有相对而言高的人格魅力,但低人格魅力抵抗能力即使就也是可以有效性地使用在抗体力力检测印子Western-blotting分享 。催化表达 ,已加入了四种从缜密混合式型物职业学校一转移磷硝化作用球蛋清/肽的的策略 。但四种的策略都尚需进两步优化网络以判定低丰度球蛋清质 。
磷酸化肽的检测和磷酸化位点的确定主要MS技术:MALDI-TOF MS可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质 ,与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点 。其原理是磷酸酯酶处理后 ,磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化 ,MALDI-TOFMS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点 。二手串联质谱(MS/MS)可进行前体离子扫描 ,这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在 。磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段 ,这些特异性的片段在用二手串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子” 。二手串联质谱还可进行中性丢失扫描 ,这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4(98 u)的肽段 。另外 ,由于液相色谱分离肽降低了离子抑制效应 ,也有人用二手LC-MS/MS分析磷酸化位点 。傅立叶变换质谱进行电子捕获解离 电子捕获解离(ECD)与傅立叶变换离子回旋加速共振(FTICR)质谱相连是蛋白质、肽测序和研究蛋白质翻译后修饰的一个有力方法 。